“2014年，诺贝尔化学奖授予了超分辨率荧光显微技术，展现了光学显微技术在人类发展历程中的重要地位。如今，荧光显微技术已逐步实现从二维到三维甚至四维成像的跨越。而当下，生命科学领域亟需一种新型的‘无标记三维显微’模态，以满足活细胞三维全貌快速、高分辨、长时程成像的需求。” 南京理工大学电子工程与光电技术学院智能计算成像实验室学术带头人左超教授表示[1]。
▲图 | 左超（来源：左超）
最近，该团队提出了一种新型三维无标记显微成像技术——非干涉合成孔径光强传输衍射层析（Transport of intensity diffraction tomography with non-interferometric synthetic aperture，TIDT-NSA）。
TIDT-NSA 将基于轴向离焦的光强传输、与基于多角度照明合成孔径的思想进行有机结合，在不借助干涉的情况下，对样品的三维折射率进行定量成像与测量。
该方法不仅能将三维衍射层析的成像分辨率，拓展到非相干衍射极限，对于复杂样品还具备高衬度、抗散射、高轴向层析的三维成像能力，这为生物细胞的无标记动态三维成像提供了一种新可能。
近日，相关论文以《用于三维无标记显微成像的非干涉合成孔径光强传输衍射层析》（Transport of intensity diffraction tomography with non-interferometric synthetic aperture for three-dimensional label-free microscopy）为题，发表在 Light：Science& Application（IF 20.3）上[1]。
▲图 | 相关论文（来源：Light：Science & Application）
南京理工大学电子工程与光电技术学院左超教授与陈钱教授为共同通讯作者，博士后李加基为第一作者。
相位显微成像：从二维定性观测，到三维定量测量
据介绍，作为生命活动的基本单位的细胞大部分无色透明，通常需对其进行染色标记，才能对其清晰成像。例如，共聚焦显微技术通过荧光标记与光学层切原理，可获得细胞器与蛋白质复合物的立体结构。
然而，而外源性荧光标记物会干扰细胞机体的正常代谢活动，光漂白与光毒性也会阻碍对细胞的长时间连续观测。此外，荧光标记往往只能突出部分生物分子，因而难以获得细胞整体全貌。
▲图 | 无标记显微成像的代表——Zernike 相差显微镜。a. Zernike 与其发明的相差显微镜；b. Zernike 相差显微镜的基本原理；c-e. NIH3T3 细胞的 Zernike 相差图像，DAPI 标记细胞核的荧光图像，以及二者的叠加（来源：左超团队）
1932 年，荷兰物理学家弗里茨·泽尼克（Frits Zernike）发明了相差显微镜：根据空间滤波的原理改变物光波的频谱相位，成功将相位差转换成振幅差，从而极大地提高了透明物体在光学显微镜下的可分辨性。相衬法的发明具有划时代的意义，泽尼克因此获得 1953 年的诺贝尔物理学奖。
如今，泽尼克的相差显微技术几乎成为了所有的生物显微镜的“标配”。该技术堪称为是荧光显微成像技术的“亲密好友”，可为后者提供互补的细胞整体轮廓与形貌的信息。然而，目前该技术仍然囿于二维定性观测，无法实现三维定量测量，这给细胞的定量分析、以及后续图像处理比如计数、分割造成极大不便。
时至今日，泽尼克的思想仍然给人们带来源源不断地灵感与启发，新型的无标记显微成像技术层出不穷。其中“定量相位成像”技术因为能够对样品的相位信息进行准确量化与测量，已成为最为理想的无标记显微成像技术之一。然而，物体的相位分布实际上可被近似地视为是待测样品三维折射率分布沿垂直于二维平面上的轴向投影信息（俗称 2.5D 成像），因此该技术缺乏三维层析的能力。
而人们所期待的是，相位成像技术能获取样品的“真三维”立体构像、及其相关的空间折射率分布。因此，从二维定性观测、发展到三维定量测量，成为相位显微成像的一个必然趋势。
▲图 | 二维定量相位成像和三维折射率衍射层析成像结果的对比。（来源：左超团队）
给细胞“做CT”：光学衍射层析成像
要想对生物细胞、或组织内部各点的折射率，实现全方位即“横向+轴向”的高分辨率成像，必须实现三维相位成像，该项技术又被称之为“光学衍射层析”，其基本思想最初由光物理学先驱埃米尔·沃尔夫（Emil Wolf）于 1969 年首次提出。
传统光学衍射层析成像技术，可被看作是数字全息显微技术与经典计算机断层扫描（CT，Computed Tomography）技术的结合与拓展。前者的目的在于“定量相位测量”，即获得三维物体在某一断面上的二维投影。
由于相位延迟、和折射率、以及物体厚度的乘积均成正比，所以单幅定量相位信息仅能给出被测样品的折射率在某一角度上的积分，故无法获得折射率的详细三维分布。
而后者正是在前者的基础上，通过旋转物体、改变照明方向等方式，得到的多组定量相位信息，并重建出物体的空间折射率分布，进而实现“三维层析”。
▲图 | 光学衍射层析成像类似于给细胞“做CT”， 通过旋转物体、改变照明方向等方式得到的多组定量相位信息，并重建出物体的空间折射率分布（来源：左超团队）
“然而半个多世纪来，相位定量测量与光学衍射层析仍与‘激光’和‘干涉’密不可分。虽在光干涉在精密光学测量、引力波探测等领域展现出重大应用前景，但高度相干性光源带来了相干噪声，降低了图像的空间分辨率，影响了成像质量；复杂的干涉与光束扫描装置又使其对测量环境的要求变得十分苛刻，难以兼容现有的光学显微镜系统。”左超解释道。
从“非干涉定量相位成像”到“非干涉光学衍射层析”
虽然相位物体无法直接观察得到，它们却无时不刻、巧妙隐晦地强调着它们的存在：夜晚闪烁的星空，雨天车窗外扭曲的视野，以及晴天游泳池底明暗相间的网络结构，这些常见的情景都蕴含了相位与光强之间各种千丝万缕的联系。
1983 年，迈克尔·里德·蒂格（Michael Reed Teague）首次利用一个二阶椭圆偏微分方程，建立了光强在传播过程的变化量与相位之间的定量关系，该方程称为光强传输方程（Transport of intensity equation, TIE）。通过求解光强传输方程，我们仅需要测量待测光波场在不同传输距离上的光强分布，即可以定量地恢复出相位信息，且不需要借助干涉或额外的参考光。
▲图 |光强传输方程“非干涉”相位恢复就是通过测量这种由相位结构在离焦平面导致的光强变化反演出定量相位分布。类比来说，即是通过池底明暗相间的条纹恢复出水面的形貌（来源：左超团队）
近年来，光强传输方程已经发展成为最具代表性的相位恢复方法之一，为定量相位成像提供了一种新型的非干涉手段。
自 2012 年至今，南京理工大学左超教授、陈钱教授课题组针对基于光强传输方程的非干涉相位恢复与定量相位成像，开展了深入系统的研究工作，在其理论与应用方面的若干关键问题，如：非齐次边界条件下方程的快速求解、光强轴向微分的最优差分估计、部分相干光场下的相空间拓展、照明相干调控与成像分辨率提升等方面取得了系列研究成果。
相关成果于 2020 年受邀在 Optics and Lasers in Engineering 上发表题为《光强输方程：教程》（ Transport of intensity equation: a tutorial）的教程论文[2]，并于 2022 年出版中文专著《计算光学显微成像——光强传输方程》[3]。
▲图 | “Transport of intensity equation: a tutorial”教程论文与中文专著《计算光学显微成像——光强传输方程》（来源：左超团队）
左超表示：“光强传输方程虽有效克服了‘定量相位测量’中的‘干涉性’这一大不足，但想要实现‘三维层析’，方法仍局限于‘先相位恢复，再衍射层析’这种‘分步分治’的思想。”
他继续说道：“那么，有没有一种可能性将光强传输方程的光强二维‘面传输’拓展为三维‘体传输’，跨越 ‘相位测量’这一中间步骤，由强度图像重建直接反演物体的三维折射率分布呢？”后来，这也成为该团队重点着手解决的问题。
光强传输衍射层析（TIDT）
光强传输衍射层析（Transport of intensity diffraction tomography, TIDT）本质上是受光强传输方程所启发，更具体地来说：光强传输方程建立的是单一横断面上衍射场的光强传输与该面上的相位分布之间的关联。通过这种关联，我们可以利用待求平面附近的光强分布来重构该面上的相位分布。
这本质上是通过光强的二维“面传输”来解决二维定量相位测量问题。光强传输衍射层析将该设想进行拓展，即建立透过三维物体的一系列轴向光强分布，与该物体三维折射率分布之间的关联。通过这种关联，我们可以由轴向扫描物体所得的三维光强图像序列，重构出该三维物体的空间折射率分布。
若按照以上构想将光强传输方程法由二维扩展为三维，必须建立光强堆栈与物体的三维复折射率之间的定量关联。经该团队前期研究发现，当以倾斜光入射照明样品时，成像系统的二维光学传递函数在得到延展的同时，幅度上也会得到相应的调制。
当照明数值孔径小于物镜数值孔径时，二维相位传递函数在低频处，由于正负抵消导致响应为零，这也就意味着样品相位的低频成分丢失而无法被准确重建。
为了满足此“匹配照明条件”，该团队前期提出了基于匹配环形照明孔径的定量相位成像方法来解决上述问题。近来，该问题也被韩国科学技术院物理系的朴永根（YongKeun Park）教授团队从 Kramers-Kronig 关系的角度进行了解读。
▲图 | 二维和三维光学传递函数的统一框架以及非匹配照明下的二维频谱缺失问题。二维传递函数内的 2 个 Ewald 圆只有在匹配照条件下才可完全分离；当维度从二维拓展到三维时，在任意照明角度下，两个三维 Ewald 球壳始终可分离（来源：Light：Science & Application）
“然而，匹配照明条件在实验中很难严格满足；特别是在使用油浸物镜的高数值孔径成像系统中。这使我们难以获得高分辨率、高质量的相位图像” ，本工作的第一作者李加基博士说，“但我们在 TIDT-NSA 框架下消除了这一限制，即使在任意照明条件下都可以进行三维无标记成像。”
研究中，该团队推导出了针对二维定量相位与三维衍射层析成像的普适传递函数表达式，并将光学传递函数理论与基于 Kramers-Kronig 的定量相位成像理论，统一到同一个理论框架中。
在前期工作的基础上，课题组惊喜地发现，Kramers-Kronig 关系中所要求的解析特性，在三维空间中的任意照明角度都可以得到满足，这为打破传统基于非对称照明的二维定量相位成像与衍射层析技术中 “匹配照明条件”的限制奠定了理论基础。“这就好比我们走入了一个更高维度的空间去寻找更优的解决方案。”李加基比喻道。
基于上述思路，研究团队构建了 TIDT-NSA 的显微硬件系统。该系统将传统明场显微镜的照明光源，替换为一个可编程多个同心圆环的 LED 照明单元，从而可从不同照明角度照射待测样品，并采集样品在不同照明角度下的多个光强堆栈图像。
在算法重建时，首先将对数运算之后的各个照明角度下的三维光强堆栈进行三维傅里叶变换，然后在频域中对其所对应的两个“背靠背”的 Ewald 球壳进行分离并合成孔径，最终基于成像系统的三维传递函数，进行反卷积与非负约束正则化后，即可实现对厚物体折射率分布的定量三维重建。
▲图 | TIDT-NSA的显微硬件系统与图像重建流程（来源：Light：Science & Application）
无需干涉、无需染色的三维显微成像
在该研究中，课题组通过多组仿真与生物样品实验，包括人类乳腺癌细胞、人类肝细胞癌细胞、小鼠巨噬细胞和秀丽隐杆线虫，展示了 TIDT-NSA 对具有复杂结构的三维生物样品进行非干涉、无标记、高分辨三维显微成像的能力。
得益于系统轴向焦距扫描与多角度照明合成孔径，TIDT-NSA 技术可实现横向分辨率为 206nm、轴向分辨率为 520nm 的高质量无标记三维层析重构，且可实现在轴向重构深度超过 100μm 的范围内复杂三维结构及散射情况下的三维折射率层析成像。
课题组利用 TIDT-NSA 对全视场成像范围内秀丽隐杆线虫的三维折射率分布进行了衍射层析重建，重构结果验证了 TIDT-NSA 对结构复杂的厚生物样本具有较好的三维成像解析力与光学切片能力。
▲图 | 固定秀丽隐杆线虫的折射率层析重建以及三维渲染结果（来源：Light：Science & Application）
此外，课题组还利用 TIDT-NSA 对动态 HeLa 细胞的三维折射率进行了重建，并展示了细胞在生长过程中的三维形貌及折射率分布的动态变化。
实验中，研究人员将单次三维成像所需获取的光强图像数目减少至 204 幅强度图像，从而仅需 30 秒即可对全视场内的细胞进行完整的三维折射率成像。
在成像结果中，细胞整体形貌与内部细胞器结构细节都可以被清晰分辨，如细胞外围的丝状伪足和内部的核膜结构，且整个动态连续观测时长达 90 分钟以上。这一长时程、高分辨、动态无标记三维成像的结果，展示了 TIDT-NSA 对动态生物样品，特别是活细胞成像方面的应用潜力。
▲图 | HeLa细胞动态衍射层析分布及三维折射率分布渲染结果 （来源：Light：Science & Application）
“以基础研究创新引领产业技术突破”
该团队提出的基于“三维光强传输”的非干涉合成孔径的光学衍射层析（TIDT-NSA）理论与方法，完备且直观地揭示了非干涉相位恢复与衍射层析理论背后的物理图景，并展示了严格的相干和干涉测量，不再是定量相位成像与光学衍射层析的先决条件。
可以说，“光强传输衍射层析”有望为传统显微镜打开崭新的视野，为新一代无标记三维显微技术开辟崭新的途径，并有望在生命科学与生物医学的各个分支领域得到广泛应用。
▲图 | 左超指导研究生做实验（来源：左超团队）
据悉，先进光学成像与高端光学仪器是支撑国家安全、国民经济、工业生产和科学研究不可或缺的重要工具，也是中国严重对外依赖的“卡脖子”技术与产品。
据悉，该团队在计算光学成像领域陆续已在国内外布局了近百项“专利池”，并已成立“南京理工大学智能计算成像研究院”新型研发机构，正开展相关技术的工程化与产业化。
团队前期已研制出新一代计算光学显微镜系列仪器与产品，包括全球首台非干涉多模态定量相位显微镜、中国首台商业化数字全息显微镜与无透镜全息显微镜等，成果获中国光学工程学会技术发明一等奖，日内瓦国际发明展 “特别嘉许金奖”等。
▲图 | 南京理工大学智能计算成像研究院（来源：左超团队）
“我坚信，计算光学成像会对未来精密光学仪器的底层机理与形态构架带来重大影响，并有望催生颠覆性和换代性的产业技术变革。我们一直朝着这个方向在努力！”左超表示。
参考资料：
1. Li, J. et al. Transport of intensity diffraction tomography with non-interferometric synthetic aperture for three-dimensional label-free microscopy. Light Sci Appl 11, 154 (2022).
2. Zuo, C. et al. Transport of intensity equation: a tutorial. Optics and Lasers in Engineering 135, 106187 (2020).
3. 左超 & 陈钱. 计算光学显微成像——光强传输方程. (科学出版社, 2022).
左超课题组：www.scilaboratory.com
