【PhotoniX】PhotoniX 封面 | 自适应光学定量相位成像——基于环形照明傅里叶叠层显微成像的实现【附解读视频】

撰稿人 | 束业峰

论文题目 | Adaptive optical quantitative phase imaging based on annular illumination Fourier ptychographic microscopy

作者 | Yefeng Shu(束业峰), Jiasong Sun(孙佳嵩), Jiaming Lyu(刘家明), Yao Fan(范瑶), Ning Zhou(周宁), Ran Ye(叶燃), Guoan Zheng(郑国安), Qian Chen(陈钱), Chao Zuo(左超)

完成单位 | 南京理工大学，上海理工大学，南京师范大学，美国康涅狄格大学

论文导读

定量相位成像[1]是一种针对透明样品的无标记成像方法，无需荧光染色就可以对细胞的生命活动进行观测。近期，南京理工大学陈钱、左超教授团队联合美国康涅狄格大学郑国安教授团队在PhotoniX上发表封面论文“Adaptive optical quantitative phase imaging based on annular illumination Fourier ptychographic microscopy”。文中，作者提出了一种自适应光学定量相位成像（AO-QPI）方法，首次在动态成像中引入了自适应的像差校正，对未染色HeLa细胞实现了长达51小时的稳定高质量成像，其间始终保持了衍射受限的成像分辨率。该方法不需要在成像系统中引入额外自适应光学硬件，在生物医学领域具有广泛的应用场景。

研究背景

对活细胞的动态成像对生物医学领域的研究具有重要意义[2-4]。通过对活细胞进行长达数小时到数天的连续成像，研究人员能够完整的记录下细胞在不同时期的动态生理行为，在细胞生物学、发育生物学、癌症和神经科学研究中被广泛的使用。然而，受制于成像系统固有的光学缺陷和机械结构的不稳定性，对活细胞进行稳定的高质量长时间成像仍然是一个极具挑战性的问题[5]。在成像过程中，环境温度的变化，载物台的沉降以及培养液的蒸发等诸多随机扰动均会对成像过程引入随时间变化的像差，极大的影响了长时间观测下细胞的成像质量与分辨率。

傅里叶叠层成像是一种实现高通量定量相位成像的有力工具[6-8]，能够在大视场范围内实现对大批量细胞的高分辨率成像。该技术基于一个传统明场显微镜和可编程LED阵列。通过依次点亮不同的LED单元来拍摄样品在不同照明角度下的低分辨率光强图。进而对原始图像进行迭代重构，实现对待测样品的大视场和高分辨率成像与定量相位成像。此外，受益于所采集光强图中信息的冗余性，傅里叶叠层成像还可以对系统光瞳函数进行恢复[9]，为基于计算的自适应光学提供了新的可能。然而，该技术在成像的时间分辨率上存在瓶颈。由于单次成像需要拍摄上百张图作为原始数据，因此需要较长的图像采集与重构时间，难以被应用到针对活细胞的高速动态成像中。

技术突破

本文提出了一种针对透明样品的自适应光学定量相位成像方法。该方法仅采用照明角度匹配物镜数值孔径的少量LED单元进行照明以获取原始数据，通过迭代重构实现定量相位恢复与像差校正。这种获取光强图的照明模式被称为匹配照明模式，是非对称照明下实现准确相位测量的必要条件。当匹配照明条件无法被满足时，系统的相位传递函数在低频处约等于零，导致样品的低频相位信息无法得到完整传递。基于此，研究团队先后提出了基于环形照明的傅里叶叠层显微成像技术（Annular-illumination based Fourier ptychographic microscopy, AIFPM）[10]和单帧傅里叶叠层显微成像技术（Single-shot Fourierptychographic microscopy, SFPM）[11]。本文进一步揭示了匹配照明模式在相位成像中对于像差重建的重要意义。当成像系统存在像差时，像差作为成像模型中光瞳函数的相位部分与样品的频谱相耦合，共同被传递到光强图中。在这个过程里像差与样品是可以相互置换，具有对偶关系的两个变量，因此像差的准确重建同样需要满足照明匹配条件。该方法的迭代重建算法流程如图1所示。通过使用所拍摄的光强图在重构中施加强度约束，样品相位和像差在经过多轮迭代更新后得到准确恢复。区别于传统的傅里叶叠层成像，该方法在环形匹配照明模式下仅需要拍摄最少六幅光强图就可以实现相位与像差的精确重建，因此满足了对活细胞实时成像和动态像差校正的需求。

图1 自适应光学定量相位成像算法流程图。

在本文中，作者首先在标准样品相位分辨率板USAF上进行了实验。在成像过程中，分辨率板被放置于离焦位置从而将成像像差扩大以验证方法的有效性。在未使用像差校正算法时(如图2(a))，严重的离焦像差导致了成像结果中高频相位信息的丢失。当使用传统方法EPRY [9]对所拍摄的121张光强图进行重建时(如图2(b))，分辨率板相位以及离焦像差能够得到完整的重建，能够在存在严重像差的情况下实现衍射受限的成像分辨率。而AO-QPI方法(如图2(c))仅使用环形匹配照明下的六幅光强图即可实现与图2(b)中使用上百张图时相当的成像效果。在未被标记的HeLa活细胞样品上,作者使用AO-QPI方法进行了长时间成像实验。通过在成像过程中实时的对像差进行动态校正，成像质量始终被维持在较高水平。图3(a)是HeLa细胞培养基在第0小时和第51小时的全视场相位成像结果。图3(a1)-(a5)给出了51小时内不同时刻下的细胞相位和成像像差，可以看到像差在长时间成像过程中已经发生了较大变化，而细胞的相位成像结果则始终保持清晰，能够观察到鲜明的亚细胞结构。图3(b1)-(b6)展示了在长时间成像中，活细胞经历三次有丝分裂的过程。受益于对细胞的稳定成像，该方法对于跨度长达数十小时的细胞生理活动能够实现完整的全过程高质量观测。

图2 对相位分辨率板成像。(a) 无像差校正成像结果；(b) 基于传统方法EPRY成像结果（使用121幅光强图）；(c) 基于AO-QPI方法成像结果（使用6幅光强图）。

图3 对HeLa活细胞51小时长时间成像结果。(a) 第0小时和第51小时全视场相位成像结果；(a1)-(a5) 51小时内不同时刻细胞相位和成像像差的重构结果；(b1)-(b6) 单个HeLa细胞经过三次有丝分裂的过程。

观点评述

本文提出了一种自适应光学定量相位成像方法，能够对成像过程中的环境扰动因素和光学像差提供动态的自适应补偿，从而实现对活细胞长时间的稳定高质量成像。相比于传统物理追焦的方法，本文提出了一种基于后期计算的解决方案，无需在成像系统中加入额外自适应光学硬件。目前，基于该方法已实现对HeLa细胞长达51小时稳定成像，其间对亚细胞结构始终保持了衍射受限的成像分辨率。该方法在细胞生物学、发育生物学等领域具有广泛的应用场景。

参考文献

[1] Park Y K, Depeursinge C, Popescu G. Quantitative phase imaging in biomedicine[J]. Nature Photonics, 2018, 12(10): 578-589.

[2] Zaretsky I, Polonsky M, Shifrut E, et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays[J]. Lab on a Chip, 2012, 12(23): 5007-5015.

[3] Schroeder T. Long-term single-cell imaging of mammalian stemcells[J]. Nature Methods, 2011, 8(4): S30-S35.

[4] Rao X, Zhang Y, Yi Q, et al. Multiple origins of spontaneously arising micronuclei in HeLa cells: direct evidence from long-term live cell imaging[J]. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2008, 646(1-2): 41-49.

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[8] Tian L, Liu Z, Yeh L H, et al. Computational illumination forhigh-speed in vitro Fourier ptychographic microscopy[J]. Optica, 2015, 2(10):904-911.

[9] Ou X, Zheng G, Yang C. Embedded pupil function recovery for Fourier ptychographic microscopy[J]. Optics Express, 2014, 22(5): 4960-4972.

[10] Sun J, Zuo C, Zhang J, et al. High-speed Fourier ptychographic microscopy based on programmable annular illuminations[J]. Scientific Reports,2018, 8(1): 1-12.

[11] Sun J, Chen Q, Zhang J, et al. Single-shot quantitative phase microscopy based on color-multiplexed Fourier ptychography[J]. Optics Letters,2018, 43(14): 3365-3368.

主要作者

束业峰，南京理工大学智能计算成像实验室博士研究生，研究方向为计算显微成像。

孙佳嵩，南京理工大学副教授，长期在光学测量与成像领域从事教学和科研工作，主要研究方向包括计算成像、显微超分辨成像和光学衍射层析。在Optics Letters、Optics Express等国际期刊上以第一作者发表论文十余篇。获中国光学学会“王大珩光学奖”，江苏省“江苏青年光学科技奖”，光学工程优博提名等奖项。

郑国安，美国康涅狄格大学（University of Connecticut）电子工程及生物医学工程专业副教授。主要研究领域包括计算显微成像、超分辨率成像、3D层析成像、片上成像系统等研究。2013年在美国加州理工学院获得博士学位，2013至今在美国康涅狄格大学任助理教授以及智能成像实验室主任。曾在NaturePhotonics, Nature Review Physics, Nature Communications, and PNAS等SCI期刊上发表论文90余篇，现任期刊BiomedicalOptics Express副主编。所提出的技术傅里叶叠层成像在谷歌学术上已被引用1300余次，并被作为一个章节写入经典光学教材《傅里叶光学导论(第四版)》。

陈钱，南京理工大学副校长，南京理工大学光学工程学科带头人，“光谱成像与信息处理”教师团队带头人。长期在光电成像与探测理论、技术与工程应用研究，取得了系列原创性成果。主持国家自然科学基金等科研任务30余项。获国家技术发明奖二等奖1项、国家科技进步二等奖1项、省部级科技一等奖5项（均排名1），第二届全国创新争先奖（2020年）；获发明专利200余项、PCT国际专利20项、美国专利9项；发表SCI论文300余篇，撰写著作3部。陈钱教授是教育部“长江学者奖励计划”特聘教授（2002年）、首批“新世纪百千万人才工程”国家级人选；带领团队入选教育部“长江学者创新团队”和 “黄大年式教师团队”；培养研究生100余名，5人获中国光学工程学会优博/提名奖。

左超，教授、博士生导师。南京理工大学智能计算成像实验室（SCILab:www.scilaboratory.com）学术带头人。研究方向为计算光学成像与光信息处理技术，在非干涉定量相位显微成像、高速结构光三维传感等领域取得系列研究成果。已在SCI源刊上发表论文180余篇，其中22篇论文被选作Light、Optica等期刊封面论文，20篇论文入选ESI高被引论文/热点论文，论文被引超过10000次。入选国家“优青”、江苏省“杰青”、 Elsevier中国高被引学者，获国际应用和纯物理协会（IUPAP-ICO）光学青年科学家奖、日内瓦国际发明展 “特别嘉许金奖”、中国光学工程学会技术发明一等奖等。现任PhotoniX、Optics and Lasers in Engineering、《激光与光电子学进展》等期刊编辑，《红外与激光工程》、中国激光杂志社青年编委等。

本文出处

发表于：PhotoniX

论文链接：

https://photonix.springeropen.com/articles/10.1186/s43074-022-00071-3