【Evident 生命科学】荧光超分辨显微术浅析与活细胞超分辨成像新进展

本文作者：钱佳铭博士

南京理工大学智能计算成像实验室

光学显微镜

光学显微镜（optical microscopy），顾名思义，是通过光学手段将人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构的光学仪器。如今，光学显微镜已发展成为许多基础研究和工程应用中的核心技术，广泛应用于生命科学、生物学、物理学、化学、材料科学、纳米技术、工业检测、医学等领域，为人类的发展做出了不可磨灭的重大贡献。

早在三百多年前，人类就已经使用光学显微镜观察肉眼无法分辨的微观物体。1662年，英国物理学家罗伯特·胡克（Robert Hooke，1635—1703年）使用自制的显微镜观察软木切片，发现其在放大后呈现出类似修道院单人居室的微观结构，并以拉丁语“Cella”（“细胞”英文单词“Cell”的由来）命名这些结构，意为“小房间”或“小隔间”。这是人类历史上第一次观察到细胞。

图1 胡克所著关于显微镜的首本书籍《显微图谱》（Micrographia）。(a) 《显微图谱》封面。(b) 胡克观察到的软木微观结构，并将其命名为“Cella”。(c) 胡克改进的复式显微镜。(d) 胡克观察到的跳蚤图像

3年后，胡克记录了使用显微镜进行的各种观察并出版了首部关于显微镜的著作——《显微图谱》（Micrographia）（图1），书中包含大量绘制精美的动、植物机体微观结构图像，开创了科学界利用图画方式进行交流的先河。《显微图谱》的出版使人们意识到微观世界和宏观世界一样丰富多彩，其中有许多未知的奥秘等待着被探索。同一时期，荷兰商人列文虎克（Antoni van Leeuwenhoek，1632—1723年）制造出当时“最强”的光学显微镜，可实现300倍放大率，并持续“称霸”了一个多世纪。

1676年春天，在用显微镜对雨水进行持续几天的观察后，列文虎克发现水中有很多在活动的小生命，并给英国皇家学会寄去了包含这些发现的信件，其中有这样一段话：“我判断，即使把一百个这些小动物撑开摆在一起，也不会超过一颗粗沙子的长度；如果这是真的，那么一百万个这些活物也不够一颗粗沙粒的体积。”这段文字中的“小动物”，就是我们现在熟知的细菌（图2）。这是人类首次发现活体细菌，并由此开创了微生物学，为人类对生物学和显微镜的研究开启了一个新时代。

随后，光学显微技术经历了不断的革新，以越来越高的分辨率与成像质量，引导人类向无尽的微观世界发起无穷的探索（图3）。特别是上世纪以来，随着人类对生命现象本质研究的逐渐深入，生命科学涉及问题的日益深化，检验医学对快速准确检测手段需求的不断提高，光学显微技术得到了突飞猛进的发展。

1873年，德国物理学家恩斯特·阿贝（Ernst Karl Abbe，1840—1905年）提出了光学成像系统的衍射极限理论，指出光学显微镜的分辨率极限大约是可见光波长的一半（约200nm），这被称为“阿贝极限”^1,2。该问题困扰着科学家长达一个世纪之久，这一时期光学显微镜的应用一直被限制在细胞水平而无法在亚细胞层面进行高分辨成像。

21世纪初，受激发射损耗显微术³（stimulated emission depletion，STED）、结构光照明显微术⁴（structured illumination microscopy，SIM）、单分子定位显微术^5,6（photoactivated localization microscopy/stochastic optical reconstruction microscopy，PALM/STORM）等超分辨成像技术绕开了百余年来似乎一直被认为是无法突破的阿贝衍射极限，在纳米尺度至单分子水平可视化生物分子，以前所未有的时空分辨率探究活细胞结构和动态过程，成为生命科学研究中不可或缺的重要工具。

2014年，诺贝尔化学奖授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner三位科学家，以表彰他们对超分辨荧光显微成像技术的重大贡献，再一次展现了该技术在人类发展历程中以及未来发展方向上的重要地位⁷。

图4 2014年，诺贝尔化学奖授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner三位科学家，以表彰他们对超分辨率荧光显微成像技术的重大贡献

· 单分子定位的显微术

在基于单分子定位的超分辨显微成像技术中，PALM由2014年诺贝尔奖得主之一Betzig⁸提出，该技术基于荧光分子的光转化能力和单分子定位，通过用光控制每次仅有少量随机离散的单个荧光分子发光，并准确定位单个荧光分子点扩散函数的中心，最终利用多次曝光叠加成一幅超高分辨率图像（图5）。

由Hess⁹提出的荧光活化定位显微术（fluorescence photoactivation localization microscopy, fPALM）与PLAM原理相似，荧光团经探测器成像后，由光强控制荧光分子被可逆地灭活或不可逆地光漂白而从视场中消失。由Zhuang等¹⁰提出的STORM技术与PALM技术在原理上类似，其利用化学小分子Cy3和Cy5、Cy7等荧光分子对的光转换效应同样可以达到突破光学极限的效果。与PALM区别在于其所利用的探针是化学小分子而不是生物大分子。因此，STORM需要利用荧光发色团标记抗体对靶蛋白进行识别，可以检测到内源性蛋白，避免PALM中由于外源性表达偶联荧光蛋白的靶蛋白对其定位产生的可能的影响。2014年，三个小组分别报道了互补式可激活型荧光蛋白系统，在哺乳动物（PAGFP¹¹和PAmCherry¹²）和大肠杆菌中（mEos3.2¹³）实现了荧光互补和超高分辨率成像，对二聚化或相互作用蛋白的超高分辨率成像具有重要应用价值。基于单分子定位的超分辨显微成像技术可实现10~30nm的横向分辨率，但由于反复激活和淬灭荧光分子，所需时间长，其时间分辨率较低。

图5 PALM原理示意图与结果图。(a)-(c) PALM原理示意图，其中图(a)为探测的单个原始光子图像，图(b)对对图(a)的高斯拟合，图(c)为定位的图(a)的中心。(d) 聚苯乙烯微球的宽场图像。(e) 叠加原始PALM堆栈数据中单分子图像所获取的聚苯乙烯微球图像。(f) 聚苯乙烯微球的PALM超分辨图像

· 受激发射损耗显微术

STED是一种基于点扩散函数调制的超分辨技术，其最早由2014年诺贝尔奖得主之一Hell^14–16提出。STED采用两束共轴激光，分别为激发光和损耗光。在激发光的照射下，基态的荧光分子吸收光子跃迁到激发态并发射出荧光；再使用环形损耗光将第1束光斑周围的荧光物质通过受激损耗过程灭活，只保留位于中间部位的纳米尺度区域以减少荧光光点的衍射面积，通过扫描记录即可获取整个样品的完整图像¹⁷。STED显微镜的横向分辨率可达20~70nm，凭借超高的分辨率，STED很快被应用于生物细胞研究并取得一系列重要的新发现¹⁷。

但是，由于STED本身属于点扫描成像技术，为了提升成像速度，STED通常需要高的激发强度（~10⁷W/cm²）来记录足够的光子以换取时间分辨率，所导致的光毒性和光漂白限制了STED在活细胞成像中的应用。

图6 STED的超分辨原理示意图和结果图16。(a) STED典型光学系统。(b) STED超分辨原理。(c) 微管宽场图

像。(d) 微管STED超分辨图像

· 结构光照明显微术

另一种典型的基于点扩散函数调制的超分辨技术是SIM技术。如前所述，成像系统的分辨率受到阿贝衍射极限的限制，存在接近波长一半尺度的衍射极限，物场信息中高于此光学传递函数截止频率的成分将会被滤除。针对这一问题，Gustafsson¹⁸于2000年提出了SIM技术，其基本原理是通过结构化照明在频域以空间混频的方式将物体高频信息载入光学系统的探测通带内实现突破阿贝衍射极限的超分辨光学显微成像。当利用周期性结构正弦照明光激发样品时，在频域上由于结构光频谱与物频谱的卷积而产生携带物体信息的多级频谱。其中±1级频谱将携带物体细节信息的高频部分平移至截止频率范围内而被探测，如图7所示。但这些高频信息与0级频谱的低频信息叠加在一起，需要后期数据处理（如相移、反卷积、参数估计等）将三级频谱分开才能有效获得样品的高频信息¹⁹。由于结构光条纹照射在样品上也受到系统衍射限制，因此等效截止频率最多可拓展一倍，即SIM的分辨率最多能在衍射极限基础上提高一倍，达到非相干衍射极限的2倍，约在100nm²⁰。尽管SIM对横向分辨率的提升不如PALM、STORM、STED等技术，但其高的光子效率、较快的成像速度和全场成像等优点使得其非常适合进行活细胞的超分辨成像。值得注意的是，光栅衍射效应不仅仅限于±1级频谱，例如矩形光栅的频谱就要丰富得多，其还包括±2级、±3级等高阶频谱。

因此，假如能采用矩形光栅作为结构光，则可以产生多级频谱，使等效截止频率得到多次拓展从而大幅提高分辨率。但由于结构光的产生也受到光学系统有限孔径的限制，直接在物平面上形成一个周期接近衍射极限分辨率的矩形光栅并不现实。针对此问题，Gustafsson²¹在传统SIM的基础上进一步提出了饱和结构光照明显微技术（saturated SIM，SSIM），巧妙地利用荧光分子的饱和激发使样品在正弦光波激发下发出具有高阶频率分量的非正弦结构光，从而实现多级频谱拓展[如图7(b)]，将分辨率提高到了约50nm的水平。然而饱和照明所需的高强度激光增加了SSIM的光毒性与光漂白，无法发挥SIM高光子效率、低光损伤的优势，使其难以运用于活细胞成像，因此并未得到广泛应用。

图7 SIM的超分辨原理示意图及超分辨结果。(a) 线性结构光照明显微术的光路及频谱调制过程。(b) 饱和结构光照明显微技术的频谱调制过程。(c) COS-7细胞中f-肌动蛋白的饱和SIM超分辨图像及不同方法的对比结果（左上：宽场，右上：反卷积，左下：SIM，右下：SSIM）。(d) 不同方法下COS-7细胞中质膜微囊的超分辨图像（左上：宽场，右上：反卷积，左下：SIM，右下：SSIM）。(e) 活体COS-7细胞中质膜微囊的SSIM超分辨结果^18,21,22

实时活细胞超分辨显微成像

在上述超分辨成像技术中，SIM具有宽视场、快速成像、光漂白和光毒性弱以及对荧光染料的非特异性需求等独特优势，因此特别适合于活细胞的长时程超分辨成像^23–25。尽管有着诸多优势，SIM仍然受到一些技术上的挑战，其高质量超分辨图像的数值重建很大程度上依赖于对照明参数的精确估计，这些参数的微小误差会对重建结果产生重大影响，导致干扰定量的重建伪影^26,27。此外，“变化多端”的照明参数对实验环境极为敏感，除非严格保持成像条件稳定，否则需要在每帧超分辨图像重建前从获取的原始观测数据中进行逐帧的照明参数提取^28,29。目前最广泛使用的基于迭代互相关（iterative cross-correlation method, COR）的参数估计法通过实空间相位梯度形式的亚像素优化提取高精度的照明参数（波矢、初相位、调制度）³⁰。然而，COR的性能受到维持活细胞长期成像所需的低光漂白和光毒性的严苛成像条件所导致的低信噪比的影响，且复杂耗时的迭代优化过程大大降低了SIM的图像重建效率，对快速、实时、长时程、无伪影的活细胞动态超分辨成像构成了严峻挑战。

近日，来自南京理工大学的陈钱、左超教授课题组提出一种高效、鲁棒的基于主成分分析的结构光照明显微技术（PCA-SIM），首次实现了在有外界干扰的复杂、低信噪比实验环境下对照明参数的快速自适应精准补偿和对活细胞精细结构的实时、高质量动态超分辨成像³¹。他们发现，理想无干扰条件下的结构光照明相量矩阵应是一个秩-1矩阵，其仅包括一个“主成分”，在最小二乘意义上描述了相量矩阵处于一个单一维度的“特征子空间”。然而，由于噪声、光学像差、样品非均匀调制度等干扰因素，通常情况下实验上所获得的相量矩阵会存在不规则的高维分量。如何消除这些高维干扰分量以获得对应理想照明相量矩阵中单一“主成分”，将是低信噪比条件下进行SIM准确参数估计的关键。

图8 基于主成分分析的结构光照明显微技术流程图。(a) 原始SIM图像及分离的三个频谱成分。(b) 被整像素频移的1级频谱。(c1) 对图b逆傅里叶变换所得频谱的相位图。(c2) 图c1中蓝色方框区域的相位图。(c3) 图c2的理想形式。(c4) 图c3的绝对相位（归一化为-π到π）。亚像素波矢表现为理想相位的斜率，但其湮没于各种干扰导致的严重噪声中。(d) 从顶部至底部依次为：原始相位，使用掩蔽算子后的相位，使用PCA后的相位，最小二乘法拟合后的相位。使用掩膜算子和PCA后，原始相位中的不相关成分被有效地去除，“净化”后的相位分布接近于理想形式。(e) 从底部至顶部依次为：获取的亚像素精度的波矢及合成的超分辨频谱

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是最重要的数据降维方法之一，其利用正交变换把由线性相关变量表示的原始数据转换到少数几个由线性无关变量表示的低维度子空间上，称为主成分。这恰恰与前面所述的从相量矩阵中准确估计照明参数所要完成的任务不谋而合。因此，研究人员利用PCA的“降维”特性，将实验采集到的照明相量矩阵中的干扰成分剔除，以提取由照明参数主导的“第一主成分”，从根本上消除了影响照明参数精确估计的干扰项，从而以简单高效的方式精准识别亚像素精度的波矢量与初相位（图8）。研究人员进一步发现，理想照明相量矩阵的离散傅里叶逆变换本质上是一个中心能量集中的狄利克雷（Dirichlet）函数。这种信号的高度局域化启发研究人员在频谱域中引入一种双窗掩膜算子，在进一步抑制噪声干扰的同时，将PCA的运算量减少约两到三个量级，极大改善了照明参数估计的计算效率、准确性和稳定性。高精度、非迭代重建、鲁棒的抗噪性和较低的运算量使PCA-SIM为快速、长时程、无伪影的活细胞超分辨成像开辟了一条新途径。

图9 研究人员基于奥林巴斯IX73倒置荧光显微镜自主搭建的三色干涉式SIM超分辨仪器示意图。激发光通过一系列二向色镜与反射镜由空间滤波器扩束准直，照射在显示高频光栅图像的空间光调制器上并发生衍射，±1级衍射光通过显微物镜在样品表面发生干涉，激发出的荧光通过物镜与二向色镜被相机接收

研究者基于PCA-SIM实现了对活体COS-7细胞线粒体的实时超分辨成像，依靠的平台是基于奥林巴斯IX73倒置荧光显微镜自主搭建的三色干涉式SIM超分辨仪器（图9）。图10给出了部分实时观测的活体COS-7细胞的线粒体动态小管事件（mitochondrial dynamic tubulation，MDT）。如图10(a)-10(b)，细长且高度动态的MDT小管从线粒体中不断延伸，并与其他线粒体发生融合，形成了两个线粒体之前的膜桥。随后MDT小管逐渐增厚并趋于稳定，最终构成线粒体网络。这些实验现象对研究线粒体网络的形成以及线粒体功能（如线粒体DNA完整性、细胞凋亡等）的维持具有重要意义。PCA-SIM为研究活细胞中纳米尺度结构演化、细胞器互作和生物分子动力学信息提供了一种快速实时、灵活便捷、低光损伤的成像新手段，在生命科学、基础医学等领域具有广阔的应用前景。

图10 在不同时间点对COS-7细胞线粒体的实时超分辨重建结果。其中线粒体通过MitoTrackerTMGreen FM标记。(a), (d) 宽场图像和PCA-SIM获得的超分辨图像。原始图像通过原始图像通过60X 1.42NA物镜（UPlanXApo 60X 1.42 Oil）获取。(b), (c) 图a中蓝色方框内区域在不同时间点的超分辨图像。(e), (f)图d中蓝色和白色方框内区域在不同时间点的超分辨图像

产品介绍

最后，我们介绍上述工作中所使用到的关键设备：

【IX3系列研究级倒置显微镜】

IX3系列(IX53/73/83)作为能提供活细胞成像的高度可扩展的光学平台，其建立在雄厚的技术基础之上，拥有灵活的结构，容易利用的光路，提供高分辨，高反差的宽场图像。一切设计基于用户的心声，科学家的工作流程需要，广泛应用在细胞生物学，神经生物学，发育生物学，分子生物学，光生物学等领域，将成为科研工作者进行更高水平的活细胞研究的有力武器。

【X Line（翼系列）平场超复消色差物镜】

X Line（翼系列）平场二代超复消色差物镜(PlanXApo)，在平场超复消色差（PlanSApo）物镜的技术基础上突破创新，在平场性、色差矫正和分辨率三项技术的层面兼收并举，同时囊括三项技术的尖端参数要求，满足高质量、大视场、高分辨率精确成像的要求，可以说，一枚物镜就可以让我们看得更多、更细、更美，也更自由。

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来源 | Evident 生命科学

排版 | 孙菲

复审 | 左超

终审 | 徐峰