利用Kramers-Kronig关系辅助傅里叶叠层衍射层析实现高效无标记三维显微成像

该研究建立了一个统一的理论框架，利用KK关系在空间域确定性地生成初始三维散射势谱，显著加速了后续FPDT迭代重建的收敛过程。KK-FPDT不仅克服了传统KK-ODT对匹配照明的依赖，还能在非匹配照明下有效提取高频信息，大幅提升了频谱覆盖率和重建质量。

图1 基于KK关系的ODT原理。(a)ODT原理：前向成像模型与重建；(b)总场U利用KK关系重建。在匹配照明下，将强度图像通过KK关系转换为相位图像；(c)POTF理论。在两个不同NAill下测量的强度图像及相应的相位传递函数；(d)在非匹配照明下利用Hilbert变换重建总场U

基于KK关系的ODT原理及相位传递函数(POTF)理论如图1所示。图1a描绘了ODT的前向成像模型与重建过程。图1b展示传统的KK-ODT利用KK关系直接从强度图像恢复复振幅，但前提是照明NA必须严格匹配物镜NA。一旦不匹配，如图1c低频相位信息会因POTF的反对称光瞳重叠而丢失。然而，该研究团队通过POTF理论分析发现，即使在非匹配照明下，未重叠的高频区域仍包含有效的相位信息。图1d的模拟结果证实，利用KK关系仍可准确恢复这些高频成分。基于此，KK-FPDT利用这些确定性的高频信息初始化散射势谱，为后续迭代提供了可靠的起点。

图2 KK-FPDT的工作流程

KK-FPDT的重建工作流如图2所示。该算法在空间域和傅里叶域之间交替进行：首先，利用KK关系从多角度照明的强度图像中重建总场的振幅和相位，生成初始的3D散射势谱；随后，在FPDT迭代框架下，结合Rytov近似和强度约束，不断更新和细化散射势谱。这种策略不仅利用了KK关系的快速计算优势，还通过FPDT的迭代优化填补了频谱缺失，实现了速度与质量的双重提升。

图3 模拟比较使用KK-ODT和KK-FPDT进行的三维折射率重建。(a)使用KK-ODT对模拟微球进行的光学断层扫描重建。在45个匹配光照下测量的微球强度图像。通过匹配光照下的KK关系重建复杂光场波前。微球通过KK-ODT重建的正交RI切片和散射势谱；(b)使用KK-FPDT对模拟微球进行的光学断层扫描重建。在128个匹配和非匹配光照下测量的微球强度图像。通过非匹配光照下的KK关系重建复杂光场波前。微球通过KK-FPDT重建的正交RI切片和散射势谱；(c)沿白色虚线的微球剖面在x-y平面和x-z平面中绘制；(d)基于KK-FPDT结果并使用非负迭代约束重建的模拟微球正交RI切片和散射势谱

为了验证算法性能，研究团队首先进行了微球仿真实验。图3对比了KK-ODT与KK-FPDT的重建结果。由于照明角度有限，图3a展示出KK-ODT只能获取少量的散射势谱，导致重建的RI值被低估，且背景噪声明显。相比之下，KK-FPDT结合了全角度照明，成功填充了更宽的频谱范围，重建出的RI分布背景均匀，且与真实值高度一致。图3c的轮廓曲线进一步量化了这一优势，显示KK-FPDT在横向和轴向的重建精度均优于传统方法。

图4 KK-FPDT平台的光学装置及聚苯乙烯微球的定量断层实验结果。(a)KK-FPDT平台照明和成像系统的示意图。现成倒置显微镜的光源被LED阵列取代；(b)在两种不同照明角度下测得的直径为10 m聚苯乙烯微球的强度分布；(c)来自KK-FPDT及其他三维成像方法的单个聚苯乙烯微球的三维折射率重建正交切片；(d)x-y平面内沿白色虚线的聚苯乙烯微球的轮廓；(e)KK-FPDT和FPDT在迭代过程中的计算强度与测量强度的差异；(f)来自KK-FPDT和KK-ODT的聚苯乙烯微球簇的三维折射率重建正交切片；(g)基于实验中KK-FPDT结果并利用非负迭代约束重建的聚苯乙烯微球簇的折射率正交切片。右侧绘制了重建聚苯乙烯微球的三维渲染图

在实验验证阶段，团队搭建了如图4a展示的商用显微镜和LED阵列的成像系统，并对聚苯乙烯微球进行了成像。图4e的收敛曲线表明，得益于KK关系的初始估计，KK-FPDT仅需约11次迭代即可收敛，而传统FPDT则需18次，且KK-FPDT的总重建时间缩短了约34%。图4f和4g展示了微球团簇的重建结果，经过非负性约束后处理，KK-FPDT不仅消除了轴向拉伸伪影，还清晰呈现了微球的三维结构，证明了其在硬件实现上的高效性与鲁棒性。

图5 使用KK-FPDT和KK-ODT对3T3细胞进行的3D RI重建。(a)利用KK-ODT（上）和KK-FPDT（下）对3T3细胞的断层扫描结果比较；(b)两种技术在三个不同深度下对T3T细胞重建结果的比较；(c)三个深度处的RI线型剖面比较两种技术的重建性能；(d)ROI1中重建RI图的最大密度投影(MIP)；(e)两个不同断层扫描ROI在不同轴向平面的x-y横截面视图；(f)跨越亚细胞结构的线型剖面以量化重建分辨率；(g)ROI3中重建RI图的最大密度投影

该方法在生物样本成像中同样表现出色。图5展示了对3T3成纤维细胞的重建结果。图5a展示出相比于KK-ODT，KK-FPDT在分辨细胞内部脂质滴、核仁等光学致密结构方面具有更高的对比度。在图5b, 5e中观察细胞丝状伪足时，KK-FPDT能够清晰分辨出直径约为487nm的细微结构，其横向分辨率接近340nm的衍射极限，而这些细节在KK-ODT结果中几乎不可见。这表明KK-FPDT在复杂生物样本的高分辨率形态分析中具有显著优势。

图6 使用KK-FPDT对P. morum进行的三维定量折射率重建。(a)在不同照明角度下获取的原始强度图像；(b)通过三维折射率重建体积在不同轴向位置的横向切片；(c)P. morum的三维折射率渲染

面对更厚的生物样本，KK-FPDT依然保持了优异的性能。图6展示了对多细胞藻类团簇的层析成像。尽管样本具有多层结构且存在一定的多重散射，图6b展示出KK-FPDT仍能准确重建出不同深度处的细胞单元及其边缘轮廓。图6c的三维渲染图生动地展示了藻类团簇的整体形态。这些结果充分证明，KK-FPDT不仅适用于单层细胞，也能为较厚组织样本提供高质量的无标记三维定量分析。

综上所述，KK-FPDT通过巧妙结合KK关系的解析优势与FPDT的迭代优化能力，成功解决了传统无标记三维显微成像中效率与质量难以兼得的问题。该技术不再受限于匹配照明，能够充分利用所有照明角度的信息，为细胞生物学和病理学研究提供了一种强有力的高通量、高分辨率三维成像工具。

原文链接：https://doi.org/10.1002/lpor.202500705