在活细胞研究中，许多关键过程并不发生在静止的二维平面上，而是发生在三维空间中，并且具有很强的时间动态性。例如细胞膜起泡、囊泡运输、细胞骨架收缩、线粒体分裂和细胞间相互作用，都可能在秒级甚至亚秒级尺度内发生。荧光显微成像具有分子特异性和高空间分辨率，但外源标记可能改变细胞生理状态，并受到光漂白和光毒性的限制。光学衍射层析(Optical Diffraction Tomography, ODT)能够利用细胞自身折射率(Refractive Index, RI)差异进行无标记三维成像，因此成为观察透明活细胞的重要工具。
然而，传统ODT通常需要逐角度照明或干涉测量。前者会拉长采集时间，在动态细胞中引入运动模糊；后者对振动和相干散斑更敏感，也增加了系统复杂度。近期的非干涉式强度衍射层析和LED照明方法降低了硬件门槛，但当三维重建仍依赖顺序采集大量角度图像时，时间分辨率与重建质量之间仍然存在明显矛盾。针对这一问题，南京理工大学左超、陈钱团队等在Advanced Photonics发表论文，提出时空多路复用傅里叶叠层衍射层析(Spatiotemporal-Multiplexed Fourier Ptychographic Diffraction Tomography, STM-FPDT)，在普通明场显微镜基础上实现高速、无标记、三维活细胞RI成像。
图1 STM-FPDT系统用于无标记活细胞3D成像的示意图。(a)物体O(r)被可变角度平面波Uin(r)照射，产生的总透射场U(r)包括入射场Uin(r)和散射场Us(r)；(b)非干涉ODT平台的照明与成像系统简化图；(c)通过同步相机和LED触发，按照设计的时间序列点亮LED元件，并记录前向场的强度，每帧包含11张原始强度图像；(d)STM-FPDT的数据处理流程图，用未染色PLC细胞为例进行3D折射率重建
STM-FPDT的核心思路不是简单减少照明角度，而是把“照明编码”和“时空重建”同时设计。实验系统采用45个可独立控制的环形LED作为照明源，并与40×/0.75 NA物镜配合。每一帧并不采集完整45个角度，而是由9幅相干单LED强度图像和2幅非对称半环部分相干强度图像组成，共11幅原始图像。半环照明在一幅图像中并行编码多个角度的散射信息，相干照明则提供冗余约束，帮助稳定解复用和频谱更新。五帧循环后，LED照明分布回到起始状态，从而在连续时间序列中兼顾采集速度与频谱覆盖。
在算法上，作者将传统FPDT扩展到相干/部分相干混合成像框架，并把三维样品的散射势作为优化变量。重建过程中，算法根据强度测量与前向模型之间的差异迭代更新三维频谱，同时引入滑动窗口协议和时空总变分正则化。这样做的目的，是把细胞结构在x-y-z-t四维空间中的连续性作为物理先验：既不过度平滑快速变化，又能抑制由欠采样、缺失锥和噪声带来的伪影。最终，该系统在5 Hz体成像速率下实现347 nm横向分辨率和1.54 μm轴向分辨率。
图2 运动模糊会降低活细胞动态三维成像的分辨率。(a)使用所提的STM-FPDT技术，在不同深度重建的活PLC细胞折射率(RI)层析图；(b)对应四种衍射层析重建策略的照明示意图显示在第一行。第二行和第三行显示使用这些衍射重建策略在相同理论空间分辨率下，对(a)中两个感兴趣区域(ROI)重建的RI层析图；(c)四种不同重建策略的数据采集时间比较；(d)对应四种重建结果的ROI3的RI直方图；(e)显示对应的线性剖面，用来比较活细胞中慢速运动的核仁和快速运动的脂质小滴的有效成像分辨率[分别由(b)中的黄色线标出]；(f)使用三种清晰度评估函数(包括EOG、DFT和熵)来评估各种重建策略下的三维层析成像质量，突出显示了STM-FPDT所取得的优越成像质量
为了验证高速采集的必要性，论文首先分析了活细胞三维成像中的运动模糊问题。研究人员以未染色原代肝癌(PLC)细胞为样品，对比四种具有相同理论空间分辨率的重建策略：45角度FPDT、45角度环形强度衍射层析(aIDT)、11角度稀疏FPDT和STM-FPDT。结果显示，对于运动较慢、尺寸较大的核仁结构，45角度FPDT和STM-FPDT都能给出较接近的重建质量；但对于运动更快、尺度更小的脂滴等细胞器，长时间采集会明显引入模糊，而单纯减少角度又会造成频谱信息不足和RI低估。
STM-FPDT的优势在于用11幅测量图像获得足够的频谱约束，相比传统45角度FPDT将采集时间缩短约4.5倍。图2中的线剖面、RI直方图以及清晰度评价指标均表明，STM-FPDT既避免了稀疏角度带来的信息缺失，也显著减轻了顺序多角度采集造成的运动模糊。这一点对活细胞三维成像尤为关键，因为图像质量下降往往并不是显微镜空间分辨率不足，而是样品在采集过程中已经发生了位移或形变。
图3 PLC细胞质膜起泡和肌动蛋白动态的可视化。(a)03:36时刻PLC细胞在0 μm z平面重建的RI分布；(b)展示(a)中黄色方框内四个不同深度的RI结果。箭头指向的黑色区域表示质膜吞饮作用和胞吐过程中形成的囊泡，其RI低于介质，内部含有空腔；(c)沿(a)中橙色箭头方向的时序图，显示质膜在吞饮作用和胞吐过程中的起伏和折叠；(d)展示(a)中黄色方框内不同时间点囊泡的面积比例；(e)不同时间点吞饮作用和胞吐现象的可视化；(f)囊泡融合和消失事件的代表性例子；(g)在z=160 μm时清楚地观察到细胞边界的肌动蛋白丝；(h)在不同时间点观察肌动蛋白丝的变化。第二行显示在12:14时丝断裂的现象；(i)重建图像中背景区域的RI直方图及高斯拟合曲线分布。根据高斯拟合得到的标准差，STM-FPDT的RI成像精度为1.18×10−3；(j)在200个不同时间点测得的平均RI成像精度；(k)垂直于肌动蛋白丝的线的平均RI分布（在几乎相同肌动蛋白丝的100个时间点测得）；(l)在100个时间点测量的(k)中标记的垂直于肌动蛋白丝的剖面平均FWHM值约为610nm
在生物应用验证中，作者首先展示了PLC细胞膜相关动态。图3中，细胞内部出现的低RI暗区被解释为胞饮和胞吐过程中形成的囊泡。通过在不同z平面观察RI分布，STM-FPDT能够区分囊泡在三维空间中的位置，并记录细胞膜折叠、起泡、囊泡融合和消失等过程。论文还沿指定线段构建时间-空间图，展示了约23分钟内细胞膜形态和囊泡占比的变化，为无标记研究胞内运输和代谢调控提供了定量入口。
更细的结构也能被捕捉到。作者在细胞边缘的丝状伪足区域观察到肌动蛋白相关结构，并通过100次测量统计背景RI精度，得到约1.18×10^-3的RI成像精度；对肌动蛋白纤维横向轮廓进行高斯拟合后，测得全宽半高约610 nm。这些结果说明，STM-FPDT不仅能够给出细胞整体轮廓，也能在无荧光标记条件下观察亚细胞骨架相关动态。
图4 PLC细胞线粒体动力学的可视化。(a) 在07:12时间点，重建的0 μm z平面RI分布的放大区域；(b)展示(a)中绿色方框内不同时间点的RI断层图，清晰展示线粒体分裂和增殖的动态过程；(c)从9:00到13:27，沿(b)中A点的RI线图，有效监测线粒体在10:42分裂的现象；(d)沿线粒体的RI线图显示其直径为746 nm，为线粒体动力学提供量化信息；(e)0.49μm z平面RI断层图的另一个子区域及对应白色框区域的直方图；(f)给出(e)中黄色矩形框内线粒体形态变化的可视化；(g)-(h) 分别为(e)中蓝色和橙色方框内线粒体与脂质小滴及囊泡的典型细胞内相互作用示例
线粒体是细胞代谢和能量调控的重要细胞器，其形态变化与细胞状态密切相关。图4展示了STM-FPDT对线粒体动态的追踪能力。在线粒体分裂过程中，线粒体先发生双向延伸，中部形成变细的颈部结构，随后分裂为新的线粒体。作者通过跨越分裂点的RI线剖面记录到10:42时刻的分裂事件，并测得线粒体直径约746 nm，符合通常0.5-1.0 μm的尺度范围。
除了单个线粒体的分裂，论文还展示了线粒体与脂滴、囊泡之间的动态联系。脂滴可沿线粒体附近移动，可能与脂质转运和能量代谢有关；囊泡则在一段时间内表现出旋转和形态变化，并逐渐被邻近线粒体包裹。由于这些过程在空间上不是单一焦平面事件，在时间上也不是静态结构，能够同时提供3D定位和RI定量的STM-FPDT为观察细胞器互作提供了更直接的窗口。
图5 脂质滴跟踪及细胞间相互作用的可视化。(a)PLC细胞在起始时间点00:00时四个不同z平面重建的折射率体扫图；(b)、(c)不同时间点的细胞运动可视化；(d)聚焦于(b)绿色方框内的细胞核亚细胞结构在第一行中放大，同时相应的示意图显示了核膜（橙色）、核仁（绿色）和脂质（黄色）的分布；(e)沿z轴的细胞内脂质滴平均浓度分布在100个不同时间点测量；(f)细胞内脂质滴百分比随时间变化；(g)细胞体积随时间变化；(h)细胞间相互作用的代表性例子。体扫图包含4个相连的PLC细胞。(i)给出(h)橙色方框内不同时间点的细胞间相互作用可视化
脂滴是细胞中重要的脂质储存结构，在肿瘤、肥胖和代谢疾病研究中具有重要意义。图5显示，STM-FPDT能够在不同轴向平面清晰分辨PLC细胞中的脂滴，并对多个约1.5 μm直径的脂滴进行同步定位和轨迹追踪。结合三维分割，作者进一步统计了脂滴沿z轴的平均浓度分布，以及脂滴体积分数和细胞体积随时间的变化。这意味着该技术不仅可以“看见”细胞器，还能把动态影像转化为可用于细胞状态分析的定量指标。
论文最后展示了细胞间相互作用过程。四个完成分裂后的PLC细胞在生长过程中出现膜收缩、膜扩张和细胞边界模糊等现象；随着膜融合推进，相邻细胞间的边界逐渐减弱，并伴随丝状线粒体在细胞之间迁移。约21分钟后，线粒体迁移完成，细胞形态逐渐收缩，边界重新变得清晰。对于免疫反应、组织修复和肿瘤转移等过程，细胞迁移和细胞间通信都是关键问题，STM-FPDT提供了一种在无标记条件下长期、定量观察这些过程的可能路径。
总体而言，这项工作把可编程环形LED照明、相干/部分相干混合编码、傅里叶叠层衍射层析和时空协同优化结合起来，解决了活细胞ODT中“高空间分辨率需要多角度采集，而多角度采集又会降低时间分辨率”的矛盾。其硬件改造相对简单，不需要干涉光路，可在标准明场显微镜上扩展；其算法则通过多路复用采集和四维先验约束，在保持三维RI重建质量的同时显著提升体成像速度。未来，如果进一步结合深度学习、物理约束神经网络或自适应照明策略，STM-FPDT有望在更复杂样品、更长时程和更高通量的活细胞生理研究中发挥作用。
原文链接：
https://doi.org/10.1117/1.AP.8.2.026003
撰稿人：谷亚宁
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